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实验报告


：

一、分离与培养
：

1
、无菌条件下
，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织

，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶）

，混悬10s
，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3

、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液

，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4
、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶

，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基

，用温育的PBS冲洗细胞2次

，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3
、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5
、PBS冲洗细胞3次，每次10min
，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

兔牙髓干分离自牙髓组织
；牙髓组织位于牙齿内部的牙髓腔内
。牙髓腔的外形与牙体形态大致相似，牙冠部髓腔较大
，称髓室
，牙根部髓腔较细小
，称根管

，根尖部有小孔，称根尖孔。牙髓组织主要包含神经、血管
，淋巴和结缔组织，还有排列在牙髓外周的造牙本质细胞
，其作用是造牙本质。牙髓因受到病源刺激物的作用不同以及机体抵抗力的差异

，出现不同的病理变化，在临床上会表现为一系列不同的症状和体征。牙髓充血状况持续时间较长后，转化为急性牙髓炎症。间充质干细胞(mesenchymal stem cells
，MSCs)来源于胚胎时期的中胚层组织，具有很强的自我复制和多向分化潜能，具有向脂肪细胞
、成骨细胞、软骨细胞及肌细胞等多种终末细胞定向分化的能力
，运用 MSCs来修复软骨损伤具有很好的应用前景，目前已能够从骨髓、脂肪
、滑膜
、骨骼、肌肉等组织以及羊水
、脐带、脐带血中分离和制备间充质干细胞。

方法简介：

实验室分离的兔牙髓干采用胶原酶消化法
、低密度稀释克隆制备而来

，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶
。

质量检测

实验室分离的兔牙髓干经CD90免疫荧光鉴定
，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体
、细菌
、酵母和真菌等。

培养信息
：

培养基：含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性
：贴壁

细胞形态：成纤维细胞样

传代特性：可传3-5代左右

消化液：0.25%

培养条件
：气相


：空气
，95%；CO2，5%

兔牙髓干体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的佳培养状态
。

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好

，培养液是否有漏液、浑浊等现象
，若有上述现象发生请及时和242net必赢联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息
，如细胞形态

、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等
，确保细胞培养条件一致
，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担
。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面
，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化
，悬浮细胞直接混匀收集细胞
，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，
，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片
，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和242net必赢联系，告知细胞的具体情况，以便242net必赢的技术人员跟踪回访直至问题解决
。

7. 该细胞仅供科研使用

。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 
。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

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