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小鼠肝炎病毒PCR检测试剂盒反应五要素
点击次数 ：561 更新时间：2021-03-16
反应五要素：
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶 、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上 ，只要知道任何一段模板DNA序列 ， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则 ：
①引物长度 ： 15-30bp ，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度 ： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段 。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳 ，G+C过多易出现非特异条带。ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补 ，否则会形成引物二聚体 ，产生非特异的扩增条带 。
⑤引物3'端的碱基，特别是末及倒数第二个碱基 ，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点 ， 被扩增的靶序列有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增 ，且可增加引物之间形成二聚体的机会 。