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反应五要素：

 

参加PCR反应的物质主要有五种即引物

、酶、dNTP、模板和Mg2+

 

引物：引物是PCR特异性反应的关键
，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度
。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物
，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增
。设计引物应遵循以下原则

：

 

①引物长度
： 15-30bp
，常用为20bp左右。

 

②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜
，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

 

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC*随机分布
，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列

。

 

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体
，产生非特异的扩增条带
。

 

⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败
。

 

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列*有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处
。

 

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

 

引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol
，以*引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会
。

 

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